Об утверждении Методики производства молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства лекарственных средств для ветеринарного применения

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПРИКАЗ Москва 4 апреля 2019 г. № 169 Об утверждении Методики производства молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства лекарственных средств для ветеринарного применения Зарегистрирован Минюстом России 29 мая 2019 г. Регистрационный № 54775 В соответствии с пунктом 13 Правил государственной регистрации генно-инженерно-модифицированных организмов, предназначенных для выпуска в окружающую среду, а также продукции, полученной с применением таких организмов или содержащей такие организмы, включая указанную продукцию, ввозимую на территорию Российской Федерации, утвержденных постановлением Правительства Российской Федерации от 23 сентября 2013 г. № 839 (Собрание законодательства Российской Федерации, 2013, № 39, ст. 4991; 2014, № 25, ст. 3317; 2017, № 28, ст. 4145; 2018, № 6, ст. 896; № 41, ст. 6260), приказываю: Утвердить прилагаемую Методику производства молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства лекарственных средств для ветеринарного применения. Министр Д.Н.Патрушев УТВЕРЖДЕНА приказом Минсельхоза России от 4 апреля 2019 года № 169 МЕТОДИКА производства молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства лекарственных средств для ветеринарного применения 1. Настоящая Методика устанавливает порядок проведения молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства лекарственных средств для ветеринарного применения (далее - исследование, ГМО соответственно). 2. Исследование проводится организацией (испытательной лабораторией), аккредитованной в национальной системе аккредитации, с областью аккредитации, соответствующей исследованиям, указанным в настоящей Методике. 3. В рамках исследования осуществляется анализ представленных юридическим лицом, осуществляющим на территории Российской Федерации генно-инженерную деятельность в целях создания ГМО (далее - заявитель), документов и данных: а) наименования ГМО с указанием его таксономического статуса; б) полного наименования, места нахождения, идентификационного номера налогоплательщика (ИНН) заявителя; в) полного наименования и места нахождения юридического лица либо фамилии, имени, отчества (при наличии), места жительства индивидуального предпринимателя - изготовителя образцов ГМО; г) вида предполагаемого целевого использования ГМО; д) сведений об исходном организме-реципиенте (таксономическая характеристика с указанием метода идентификации; источник выделения штамма: субстрат, географический пункт, дата выделения; методы идентификации штамма, кем идентифицирован (фамилия, имя, отчество (при наличии)), ссылка на использованные определители); е) сведений о трансформационном событии в виде кода, сформированного согласно Общероссийскому классификатору трансформационных событий; ж) информации о месте депонирования и коллекционном номере штамма ГМО, паспорта штамма ГМО (для депонированных штаммов ГМО) либо информации о культурально-морфологических, физиолого-биохимических (ферментативных), антигенных, биологических свойствах и генетических особенностях штамма ГМО; условиях культивирования: наименованиях питательных сред, рН среды, температуре и продолжительности выращивания, сроке хранения и периодичности пересева культуры штамма ГМО в нативной форме; о применяемом способе и условиях хранения штамма ГМО: в случае лиофилизации указывается продолжительность выращивания на питательной среде (возраст культуры), состав защитной среды, титр клеточной суспензии, режим высушивания, температура хранения, срок хранения; в случае криоконсервации указывается продолжительность выращивания на питательной среде (возраст культуры), состав защитной среды, титр клеточной суспензии, скорость замораживания (град/мин), температура хранения, срок хранения; о диссоциации культуры в зависимости от метода хранения (описание морфологических типов колоний на конкретной среде с подробным описанием типа колонии, сохраняющего полезный или диагностический признак); о среде, на которой заявителем предоставляется штамм ГМО; о количестве, дате приготовления и сроке годности образцов штамма ГМО (в случае непредставления информации о месте депонирования и коллекционном номере штамма ГМО, паспорта штамма ГМО); з) описания структуры, внесенной или удаленной генетической конструкции и места ее локализации, характеристик встроенных или измененных генов; и) информации о генетической модификации: описание метода модификации, структуры вектора, структуры вставки, расположения рекомбинантной ДНК (хромосома, плазмида, мобильные элементы), включая фланкирующие последовательности, включения в состав мобильных генетических элементов; к) информации об организмах-донорах вносимых генов (с указанием группы патогенности при наличии); л) описания методики, позволяющей идентифицировать ГМО, в том числе описания нуклеотидных последовательностей, используемых праймеров, зондов и условий полимеразной цепной реакции (далее - ПНР); м) регистрационного номера свидетельства о государственной регистрации ГМО, предназначенного (предназначенных) для выпуска в окружающую среду, на основе которого (которых) создан ГМО, в отношении которого проводится исследование (в случае, если ГМО создан на основе иного (иных) ГМО); н) регистрационного номера свидетельства о государственной регистрации ГМО для иного целевого использования (при наличии); о) информации о регистрации ГМО за рубежом (при наличии); п) данных полногеномного секвенирования ГМО (при наличии). Заявителем ГМО для исследования предоставляются образцы ГМО и исходного организма-реципиента. 4. В рамках исследования осуществляются следующие испытания предоставленных заявителем образцов ГМО и исходного организма-реципиента: а) проверка (валидация) методики идентификации ГМО, в том числе оценка чувствительности и специфичности данной методики в соответствии с критериями эффективности, указанными в таблице № 1 приложения к настоящей Методике; б) подтверждение присутствия (отсутствия) заявленной генетической модификации в геноме ГМО; в) подтверждение присутствия (отсутствия) маркерных и селективных генов в геноме ГМО, указанных в таблице № 2 приложения к настоящей Методике; г) полногеномное секвенирование ГМО, который содержится в продукции в жизнеспособном виде (в случае непредставления заявителем ГМО данных полногеномного секвенирования ГМО, представляющего собой плазмиду, вирус (бактериофаг), бактерию или одноклеточное простейшее, животное, гриб), проведенного с использованием методики полногеномного секвенирования, соответствующей критериям эффективности, указанным в таблице № 3 приложения к настоящей Методике. 5. Полногеномное секвенирование ГМО проводится с использованием методики полногеномного секвенирования, соответствующей критериям эффективности, указанным в таблице № 3 приложения к настоящей Методике. 6. Результаты исследования оформляются заключением о результатах исследования, составляемым на основании протоколов испытаний, которое должно содержать: наименование заключения; полное наименование и место нахождения организации (испытательной лаборатории), осуществившей проведение исследования; наименование ГМО с указанием его таксономического статуса; полное наименование, место нахождения, идентификационный номер налогоплательщика (ИНН) заявителя; полное наименование и место нахождения юридического лица либо фамилия, имя, отчество (при наличии), место жительства индивидуального предпринимателя - изготовителя образцов ГМО; вид предполагаемого целевого использования ГМО; место депонирования и коллекционный номер (указывается для депонированных штаммов ГМО); сведения о трансформационном событии в виде кода, сформированного согласно Общероссийскому классификатору трансформационных событий; регистрационный номер свидетельства о государственной регистрации ГМО, предназначенного (предназначенных) для выпуска в окружающую среду, на основе которого (которых) создан ГМО, в отношении которого проведено исследование (в случае если ГМО создан на основе иного (иных) ГМО); регистрационный номер свидетельства о государственной регистрации ГМО для иного целевого использования (при наличии); сведения о регистрации ГМО за рубежом (при наличии); оценку полноты представленных заявителем документов и данных; краткое содержание представленных заявителем документов и данных; описание представленных заявителем образцов ГМО и исходного организма-реципиента с указанием их количества, а также оценку их пригодности для проведения исследования; выводы о результатах исследования: о молекулярно-генетической структуре ГМО, об отсутствии или наличии не заявленных генетических конструкций, об эффективности метода идентификации ГМО, сведения о соответствии генетической модификации природным (естественным) процессам; фамилии, имена, отчества (при наличии), должности, места работы, ученые степени (при наличии) лиц, проводивших исследование; дату и номер заключения; подпись руководителя организации (испытательной лаборатории), осуществившей проведение исследования. 7. К заключению о результатах исследования должны прилагаться протоколы испытаний, на основании которых оно составлено, подписанные лицами, проводившими испытания. 8. В случае если заявителем не представлены документы и данные, предусмотренные настоящей Методикой, и (или) образцы ГМО и исходного организма-реципиента, пригодные для проведения исследований, в количестве, необходимом для проведения исследований, исследование не проводится. Заявителю должен быть выдан мотивированный отказ в проведении исследования, подписанный руководителем организации (испытательной лаборатории), аккредитованной в национальной системе аккредитации, с областью аккредитации, соответствующей исследованиям, указанным в настоящей Методике, в которую обратился заявитель для проведения исследования. Приложение к Методике производства молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства лекарственных средств для ветеринарного применения Таблица № 1. Критерии эффективности методики идентификации ГМО N п/п Характеристика Описание характеристики Критерий Методы оценки критерия 1Специфичность ПЦРСпособность ПЦР-тест-системы выявлять только целевую нуклеиновую кислоту (далее - НК)ПЦР-тест-система должна выявлять целевую НК. ПЦР-тест-система не должна давать ложноположительных результатов, в том числе выявлять НК близкородственных и неродственных биологических видов, в 100% проводимых исследованийДля оценки специфичности используют контрольные панели образцов. В состав панели входят образцы, содержащие целевую НК и не содержащие целевую НК 2Чувствительность ПЦРНаименьшее содержание копий целевой НК, которое может быть определено с использованием данной ПЦР-методики, в первую очередь зависит от свойств используемых праймеров и зондовЧувствительность должна быть не ниже 100 копий целевой НК, например, плазмидной, в одной ПЦРПроводят исследования ряда десятикратных разведений целевой плазмидной НК с известной концентрацией в двух повторах каждое. Определяют максимальное разведение, при котором НК воспроизводимо выявляется (в двух повторах) 3Эффективность ПЦРХарактеризует прирост матрицы на каждом цикле амплификацииЭффективность ПЦР должна быть не ниже 90%. Это соответствует значению наклона линейной области зависимости Ct от логарифма концентрации ДНК матрицы (slope): не ниже 3,6 (приемлем диапазон slope 3,1 - 3,6)Для оценки эффективности ПЦР проводят амплификацию с рядом десятикратных разведений целевой плазмидной НК (пункт 2 настоящей таблицы) в двух повторах каждое. Строят график зависимости Ct от логарифма концентрации НК матрицы. Определяют наклон линейной области (slope). Эффективность ПЦР оценивают по уравнению: Е = [10(-1/slope)]-1 В идеальном случае - при удвоении количества ПЦР продукта за один цикл: Е = 100%, (slope = -3,32) 4Предел обнаружения ПЦР-тест-системы (LOD)Отражает минимальное количество биологического искомого объекта в исследуемом образце, которое может достоверно обнаружить данный методЧем меньше искомого биологического объекта способен выявить метод, тем выше его чувствительность. Определяется экспериментально, но должен составлять не более 0,1%Готовят ряд модельных образцов с разным содержанием целевой матрицы. Готовят образцы целевого ГМО-ингредиента (от 5% до 0,001% содержания) в соответствующей матрице. Исследуют приготовленную панель с использованием ПЦР-методики. Определяют минимальное содержание ГМО-ингредиента в тотальной НК организма, при котором ГМО воспроизводимо выявляется (в десяти повторах) 5Предел количественного определения (LOQ)Наименьшее количество (концентрация) вещества в образце, которое может быть оценено с использованием методики с требуемой правильностью и внутрилабораторной прецизионностьюДля методик ГМО предел должен быть не более 0,1%. На пределе чувствительности относительное стандартное отклонение (RSD) для методик ГМО не должно превышать 20%. Истинное значение измеряемой величины должно входить в полученный при измерениях доверительный интервалИсследуют 10 повторов 0,1% ГМО-стандарта по ПЦР-методике. Рассчитывают среднее значение содержания ГМО в образце и относительное стандартное отклонение (RSD). Сравнивают рассчитанное стандартное отклонение (RSD) с критерием 20%. Также оценивают, входит ли истинное значение в доверительный интервал полученного среднего значения 6Аналитическая область (dynamic range)Интервал определяемых аналитических характеристик, в котором получаемые результаты имеют приемлемый уровень правильности и прецизионности. Для ГМО-методик обычно приемлем диапазон 0,1% - 5%Диапазон 0,1% - 5% ГМО экспериментальных данных, должен удовлетворять линейной модели (пункт 7 настоящей таблицы)Проводят исследования образцов с различным содержанием ГМО. Оценивают линейность зависимости аналитического сигнала 7ЛинейностьНаличие линейной зависимости аналитического сигнала в анализируемой пробе в пределах аналитической области методики. Оценивается как R 2 - коэффициент корреляции, определяющий верность модели линейной зависимости Ct от логарифма концентрации калибровочных образцовR 2 - коэффициент для калибровочных образцов должен быть не менее 0,98%Исследуют в двух повторах 0,1%, 1,0% и 5,0% калибровочные ГМО-стандарты по ПЦР-методике. Строят калибровочную прямую (dCt от lgC), оценивают коэффициент корреляции данных с линейной зависимостью (R 2 ) 8ПравильностьПравильность методики характеризуется отклонением среднего результата определений, выполненных с ее использованием, от значения, принимаемого за истинноеМетодика дает корректные результаты, если значения, принимаемые за истинные, лежат внутри доверительных интервалов соответствующих средних результатов анализов, полученных экспериментально по данной методикеГотовят образцы из калибровочных стандартов 0,1%, 1,0% и 5,0% с добавлением матриц различного происхождения (для этого смешивают стандарты с другими ингредиентами, сухим молоком, мясным фаршем, рыбной мукой). Исследуют образцы по ПЦР-методике в двух повторах. Оценивают, входит ли истинное значение в диапазон погрешности полученного среднего значения для каждого образца При использовании методики, основанной на ПЦР, исследование включает последовательные процессы: подготовку проб, выделение нуклеиновых кислот из образцов, амплификацию заданных фрагментов нуклеиновых кислот, детекцию продуктов амплификации, анализ и интерпретацию результатов. Таблица № 2. Основные маркерные и селективные гены, являющиеся составляющими частями генно-инженерных конструкций Мишень ОписаниеГен LacZКодирует фермент b-галактозидазу. Используется в векторных плазмидных конструкциях (pCR2.1 ТОРО, pVIK112, pBSKSII и других), включает область полилинкера для клонирования рекомбинантных генов. При наличии данного фермента бесцветный субстрат X-gal превращается в окрашенный продукт, бактериальные колонии, экспрессирующие LacZ, имеют голубой цветГен gfpГен зеленого флуоресцентного белка используется в ряде векторных плазмид для генно-инженерных манипуляций (pKEN-gfpmut2, pRK415-gfp) в качестве светящейся меткиГен ampКодирует устойчивость к ампициллину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по антибиотикоустойчивости (pBR322, pUC18, pBSKSII, рЕТ, pCR2.1 ТОРО)Ген KmКодирует устойчивость к канамицину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по антибиотикоустойчивости (pVIK112, pMC212)Ген tetOКодирует устойчивость к тетрациклину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по антибиотикоустойчивости (pBR322)F1 oriОриджин репликации плазмид (pBSKSII, pKEN-gfpmut2, pCR2.1 TOPO)Транспозон Tn7LФрагмент обеспечивает транспозицию рекомбинантных генов из плазмид в геном (pRK415-gfp)Ген ermCКодирует устойчивость к эритромицину, плазмидные векторыГен catКодирует устойчивость к хлорамфениколу, плазмидные векторыR6K oriОриджин репликации плазмид (pVIK112) Таблица № 3. Критерии эффективности методики полногеномного секвенирования Этап анализа Характеристика Описание характеристики КритерийПодготовка библиотеки дляКонцентрация геномной ДНК Не менее 0,2 нг/мклсеквенированияРазмер фрагментов ДНКРаспределение фрагментов по длинам, устанавливается электрофоретическиРаспределение в диапазоне 250 - 1000 п.н. Максимум распределения 300 - 500 п.н.Проведение массового параллельного секвенированияРаспределение качества идентификации нуклеотидовQ= -10log10p, где р - вероятность неправильного определения нуклеотидаQ > 20, то есть вероятность ошибки не более 0,01 Среднее качество прочтения Q > 25 Служебные последовательностиНаличие служебных последовательностей (адаптеров, индексов) в прочтенииДолжны отсутствовать Покрытие чтенияЧисло чтений, содержащих определенный нуклеотид последовательности геномаНе менее десятикратного покрытия Представленность нуклеотидов в каждом циклеМаксимальное отклонение между А и Т или G и СНе более 20% в любой позиции GC-состав на прочтениеСумма отклонений от ожидаемого распределенияНе более 30% прочтений