Об утверждении Методики производства молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства кормов и кормовых добавок для животных, а также кормов и кормовых добавок для животных, полученных с применением таких организмов или содержащих такие организмы

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПРИКАЗ Москва 22 марта 2019 г. № 126 Об утверждении Методики производства молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства кормов и кормовых добавок для животных, а также кормов и кормовых добавок для животных, полученных с применением таких организмов или содержащих такие организмы Зарегистрирован Минюстом России 29 мая 2019 г. Регистрационный № 54779 В соответствии с пунктом 13 Правил государственной регистрации генно-инженерно-модифицированных организмов, предназначенных для выпуска в окружающую среду, а также продукции, полученной с применением таких организмов или содержащей такие организмы, включая указанную продукцию, ввозимую на территорию Российской Федерации, утвержденных постановлением Правительства Российской Федерации от 23 сентября 2013 г. № 839 (Собрание законодательства Российской Федерации, 2013, № 39, ст. 4991; 2014, № 25, ст. 3317; 2017, № 28, ст. 4145; 2018, № 6, ст. 896; № 41, ст. 6260), приказываю: Утвердить прилагаемую Методику производства молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства кормов и кормовых добавок для животных, а также кормов и кормовых добавок для животных, полученных с применением таких организмов или содержащих такие организмы. Министр Д.Н.Патрушев УТВЕРЖДЕНА приказом Минсельхоза России от 22 марта 2019 г. № 126 МЕТОДИКА производства молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства кормов и кормовых добавок для животных, а также кормов и кормовых добавок для животных, полученных с применением таких организмов или содержащих такие организмы I. Общие положения 1. Настоящая Методика устанавливает порядок проведения молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства кормов и кормовых добавок для животных, а также кормов и кормовых добавок для животных, полученных с применением таких организмов или содержащих такие организмы (далее - исследование, ГМО, продукция соответственно). 2. Исследование проводится организацией (испытательной лабораторией), аккредитованной в национальной системе аккредитации, с областью аккредитации, соответствующей исследованиям, указанным в настоящей Методике. 3. Результаты исследования ГМО оформляются заключением о результатах исследования, составляемым на основании протоколов испытаний, которое должно содержать: наименование заключения; полное наименование и место нахождения организации (испытательной лаборатории), осуществившей проведение исследования; наименование ГМО с указанием его таксономического статуса; полное наименование и место нахождения, идентификационный номер налогоплательщика (ИНН) юридического лица, осуществляющего на территории Российской Федерации генно-инженерную деятельность в целях создания ГМО (далее - заявитель ГМО); полное наименование и место нахождения юридического лица либо фамилия, имя, отчество (при наличии), место жительства индивидуального предпринимателя - изготовителя образцов ГМО; вид предполагаемого целевого использования ГМО; место депонирования и коллекционный номер (указывается для депонированных штаммов ГМО); сведения о трансформационном событии в виде кода, сформированного согласно Общероссийскому классификатору трансформационных событий; регистрационный номер свидетельства о государственной регистрации ГМО, предназначенного (предназначенных) для выпуска в окружающую среду, на основе которого (которых) создан ГМО, в отношении которого проведено исследование (в случае если ГМО создан на основе иного (иных) ГМО), либо указание на то, что ГМО не создан на основе иного (иных) ГМО; регистрационный номер свидетельства о государственной регистрации ГМО для иного целевого использования (при наличии); сведения о регистрации ГМО за рубежом (при наличии); оценку полноты документов и данных, представленных заявителем ГМО для исследования; краткое содержание документов и данных, представленных заявителем ГМО для исследования; описание образцов ГМО и исходного организма-реципиента, представленных заявителем ГМО для исследования, с указанием их количества, а также оценку их пригодности для проведения исследования; выводы о результатах исследования: о молекулярно-генетической структуре ГМО, об отсутствии или наличии не заявленных генетических конструкций; об эффективности метода идентификации ГМО, сведения о соответствии генетической модификации природным (естественным) процессам; фамилии, имена, отчества (при наличии), должности, места работы, ученые степени (при наличии) лиц, проводивших исследование; дату и номер заключения; подпись руководителя организации (испытательной лаборатории), осуществившей проведение исследования. 4. Результаты исследования продукции оформляются заключением о результатах исследования, составляемым на основании протоколов испытаний, которое должно содержать: наименование заключения; полное наименование и местонахождение организации (испытательной лаборатории), осуществившей проведение исследования; наименование продукции; полное наименование и место нахождения юридического лица, осуществляющего изготовление (поставку) продукции (далее - заявитель продукции); регистрационный номер свидетельства о государственной регистрации ГМО, с применением которого получена продукция или который она содержит (указывается регистрационный номер свидетельства о государственной регистрации каждого ГМО, содержащегося в продукции или с применением, которого она получена); специальные условия использования ГМО, с применением которого получена продукция или который она содержит (при наличии); сведения о регистрации продукции за рубежом (при наличии); компонентный состав продукции, включая информацию о количестве ГМО (доля содержания в%); оценка полноты представленных на экспертизу документов и данных, представленных заявителем продукции для исследования; краткое содержание документов и данных, представленных заявителем продукции для исследования; описание образцов продукции, представленных заявителем продукции для исследования, с указанием их количества, а также оценку их пригодности для проведения исследования; выводы о наличии или отсутствии заявленного ГМО в образцах продукции; фамилии, имена, отчества (при наличии), должности, места работы, ученые степени (при наличии) лиц, проводивших исследование; срок действия свидетельства о государственной регистрации продукции, соответствующий сроку действия свидетельства о государственной регистрации ГМО, с применением которого получена продукция или который она содержит. Если продукция получена с применением нескольких ГМО или содержит несколько ГМО, срок действия свидетельства о государственной регистрации продукции должен соответствовать минимальному сроку действия свидетельства о регистрации ГМО, с применением которого продукция получена или который продукция содержит; дату и номер заключения; подпись руководителя организации (испытательной лаборатории), осуществившей проведение исследования. 5. К заключению о результатах исследования ГМО или продукции должны прилагаться протоколы испытаний, на основании которых составлено соответствующее заключение, подписанные лицами, проводившими испытания. 6. Требования к проведению исследования приведены в приложении к настоящей Методике. 7. В случае если заявителем не представлены документы и данные, предусмотренные настоящей Методикой, и (или) образцы ГМО и исходного организма-реципиента или образцы продукции, пригодные для проведения исследований, в количестве, необходимом для проведения исследований, исследование не проводится. Заявителю должен быть выдан мотивированный отказ в проведении исследования, подписанный руководителем организации (испытательной лаборатории), аккредитованной в национальной системе аккредитации, с областью аккредитации, соответствующей исследованиям, указанным в настоящей методике, в которую обратился заявитель для проведения исследования. II. Исследование ГМО, являющихся микроорганизмами 8. В рамках исследования осуществляется анализ представленных заявителем ГМО документов и данных: а) наименования ГМО с указанием его таксономического статуса; б) полного наименования и места нахождения, идентификационного номера налогоплательщика (ИНН) заявителя ГМО; в) полного наименования и место нахождения юридического лица либо фамилия, имя, отчество (при наличии), место жительства индивидуального предпринимателя - изготовителя образцов ГМО; г) вид предполагаемого целевого использования ГМО; д) сведений об исходном организме-реципиенте (таксономическая характеристика с указанием метода идентификации; источник выделения штамма: субстрат, географический пункт, дата выделения; методы идентификации штамма, кем идентифицирован (фамилия, имя, отчество (при наличии)), ссылка на использованные определители); е) сведений о трансформационном событии в виде кода, сформированного согласно Общероссийскому классификатору трансформационных событий; ж) информации об организмах-донорах вносимых генов (с указанием группы патогенности при наличии); з) описания структуры генетической конструкции (внесенной или удаленной) и места ее локализации, характеристики встроенных или измененных генов; и) информации о генетической модификации: описания метода модификации, структуры вектора, структуры вставки, расположения рекомбинантной ДНК (хромосома, плазмида, мобильные элементы), включая фланкирующие последовательности, включение в состав мобильных генетических элементов; к) регистрационного номера свидетельства о государственной регистрации ГМО, предназначенного (предназначенных) для выпуска в окружающую среду, на основе которого (которых) создан ГМО, в отношении которого проводится исследование (в случае если ГМО создан на основе иного (иных) ГМО), либо указания на то, что ГМО не создан на основе иного (иных) ГМО; л) описания методики, позволяющей идентифицировать генетическую модификацию, в том числе описания нуклеотидных последовательностей, используемых праймеров, зондов и условий полимеразной цепной реакции (далее - ПЦР); м) информации о месте депонирования и коллекционном номере штамма ГМО, паспорт штамма ГМО (для депонированных штаммов ГМО) либо информации о культурально-морфологических, физиолого-биохимических (ферментативных), антигенных, биологических свойствах и генетических особенностях штамма ГМО; об условиях культивирования: наименованиях питательных сред, рН среды, температуре и продолжительности выращивания, сроке хранения и периодичности пересева культуры штамма ГМО в нативной форме; о применяемом способе и условиях хранения штамма ГМО: в случае лиофилизации указывается продолжительность выращивания на питательной среде (возраст культуры), состав защитной среды, титр клеточной суспензии, режим высушивания, температура хранения, срок хранения; в случае криоконсервации указывается продолжительность выращивания на питательной среде (возраст культуры), состав защитной среды, титр клеточной суспензии, скорость замораживания (град/мин), температура хранения, срок хранения; о диссоциации культуры в зависимости от метода хранения (описание морфологических типов колоний на конкретной среде с подробным описанием типа колонии, сохраняющего полезный или диагностический признак); о среде, на которой заявителем предоставляется штамм ГМО; о количестве, дате приготовления и сроке годности образцов штамма ГМО (в случае непредоставления информации о месте депонирования и коллекционном номере штамма ГМО, паспорта штамма ГМО); н) регистрационного номера свидетельства о государственной регистрации ГМО для иного целевого использования (при наличии); о) информации о регистрации ГМО за рубежом (при наличии); п) данных полногеномного секвенирования ГМО (при наличии). Заявителем ГМО для исследования предоставляются образцы ГМО и исходного организма-реципиента. 9. В рамках исследования осуществляются следующие испытания представленных заявителем образцов ГМО и исходного организма-реципиента: а) проверка (валидация) методики идентификации ГМО, в том числе оценка чувствительности и специфичности данной методики в соответствии с критериями эффективности, указанными в таблице № 3 приложения к настоящей Методике; б) подтверждение присутствия (отсутствия) заявленной генетической модификации в геноме ГМО; в) подтверждение присутствия (отсутствия) маркерных и селективных генов в геноме ГМО, указанных в таблице № 1 приложения к настоящей Методике; г) проведение полногеномного секвенирования ГМО, который содержится в продукции в жизнеспособном виде (в случае непредставления заявителем ГМО данных полногеномного секвенирования ГМО, представляющего собой плазмиду, бактерию, одноклеточное простейшее, животное, гриб), проведенного с использованием методики полногеномного секвенирования, соответствующей критериям эффективности, указанным в таблице № 4 приложения к настоящей Методике. 10. Полногеномное секвенирование ГМО проводится с использованием методики полногеномного секвенирования, соответствующей критериям эффективности, указанным в таблице № 4 приложения к настоящей Методике. III. Исследование ГМО растительного происхождения 11. В рамках исследования осуществляется анализ представленных заявителем ГМО документов и данных, предусмотренных подпунктами "а" - "л" пункта 8 настоящей Методики, а также данных секвенирования вставки ГМО и бордерных последовательностей, не менее 100 нуклеотидов по флангам генома реципиента (при наличии). Заявителем ГМО для исследования предоставляются образцы ГМО и исходного организма-реципиента. 12. В рамках исследования осуществляются следующие испытания представленных заявителем образцов ГМО и исходного организма-реципиента: а) проверка (валидация) методики идентификации ГМО, в том числе оценка чувствительности и специфичности данной методики в соответствии с критериями эффективности, указанными в таблице № 3 приложения к настоящей Методике; б) подтверждение присутствия (отсутствия) заявленной генетической модификации в геноме ГМО; в) подтверждение присутствия (отсутствия) генетических последовательностей в геноме ГМО, указанных в таблице № 2 приложения к настоящей Методике. IV. Исследование ГМО животного происхождения 13. В рамках исследования осуществляется анализ представленных заявителем ГМО документов и данных, предусмотренных подпунктами "а" - "л" пункта 8 настоящей Методики, а также данных секвенирования вставки ГМО и бордерных последовательностей, не менее 100 нуклеотидов по флангам генома реципиента (при наличии). Заявителем ГМО для исследования предоставляются образцы ГМО и исходного организма-реципиента. 14. В рамках исследования осуществляются следующие испытания представленных заявителем образцов ГМО и исходного организма-реципиента: а) проверка (валидация) методики идентификации ГМО, в том числе оценка чувствительности и специфичности данной методики в соответствии с критериями эффективности, указанными в таблице № 3 приложения к настоящей Методике; б) подтверждение присутствия (отсутствия) заявленной генетической модификации в геноме ГМО; в) подтверждение присутствия (отсутствия) незаявленных генетических последовательностей в геноме ГМО. V. Исследование продукции 15. В рамках исследования осуществляется анализ представленных заявителем продукции документов и данных: а) наименования продукции; б) полного наименования и места нахождения заявителя продукции; в) регистрационного номера свидетельства о государственной регистрации ГМО, с применением которого получена продукция или который она содержит (указывается регистрационный номер свидетельства о государственной регистрации каждого ГМО, содержащегося в продукции или с применением, которого она получена); г) компонентного состава продукции, включая информацию о количестве ГМО (доля содержания в %); д) описания методики, позволяющей идентифицировать генетическую модификацию, в том числе описание нуклеотидных последовательностей, используемых праймеров, зондов, и условий ПЦР; е) специальных условий использования ГМО, с применением которого получена продукция или который она содержит (при наличии); ж) информации о регистрации продукции за рубежом (при наличии). Заявителем продукции для исследования предоставляются образцы продукции. 16. В рамках исследования осуществляются следующие испытания представленных заявителем образцов продукции: а) проведение идентификации заявленного (заявленных) ГМО в образцах продукции; б) проведение скрининга для подтверждения присутствия заявленных генетических модификаций в образцах продукции. Приложение к Методике производства молекулярно-генетического исследования генно-инженерно- модифицированных организмов, используемых для производства кормов и кормовых добавок для животных, а также кормов и кормовых добавок для животных, полученных с применением таких организмов или содержащих такие организмы Таблица № 1. Основные маркерные и селективные гены, являющиеся составляющими частями генно-инженерных конструкций микроорганизмов Мишень ОписаниеГен LacZКодирует фермент b-галактозидазу. Используется в векторных плазмидных конструкциях (pCR2.1TOPO, pVIK112, pBSKSII), включает область полилинкера для клонирования рекомбинантных генов. При наличии данного фермента бесцветный субстрат X-gal превращается в окрашенный продукт, бактериальные колонии, экспрессирующие LacZ, имеют голубой цветГен gfpГен зеленого флуоресцентного белка используется в ряде векторных плазмид для генно-инженерных манипуляций (pKEN-gfpmut2, pRK415-gfp) в качестве светящейся меткиГен ampКодирует устойчивость к ампициллину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по антибиотикоустойчивости (pBR322, pUC18, pBSKSII, pET, pCR2.1TOPO)Ген KmКодирует устойчивость к канамицину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по антибиотикоустойчивости (pVIK112, рМС212)Ген tetOКодирует устойчивость к тетрациклину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по антибиотикоустойчивости (pBR322)Fl oriОриджин репликации плазмид (pBSKSII, pKEN-gfpmut2, pCR2.1 TOPO)Транспозон Tn7LФрагмент обеспечивает транспозицию рекомбинантных генов из плазмид в геном (pRK415-gfp)Ген ermCКодирует устойчивость к эритромицину, плазмидные вектораГен catКодирует устойчивость к хлорамфениколу, плазмидные вектораR6K oriОриджин репликации плазмид (pVIKl 12) Таблица № 2. Основные генетические последовательности в геноме ГМО растительного происхождения ПЦР мишень ГМ линии сои, кукурузы и рапса, содержащие данный элементПромотор p-CaMV35SGTS 40-3-2, А2704-12, А5547-127, ВТ 176, ВТ11, MON810, GA21, MON88017, NK603, MON863, Т25, Т45Терминатор t-NOSGTS 40-3-2, MON863, MON531, MON757, MON1076, MON1445, MON1698, MON15985, ВТ11, GA21, NK603, MON802, 3272, MIR604, MON88017Промотор p-FMVMON89788, MON89034, GT73Промотор p-SSuAraMS1, RF1, RF2, MS8xRF3Промотор р-ТА29MS1, RF1, RF2, MS8xRF3Промотор p-NOSMS1, RF1, RF2, Topas 19-2Терминатор t-E9MON89788Терминатор t-35SВТ 176, T14, T25, 3272, A2704-12, A5547-127, T45, Topas19/2Терминатор t-OCSMS1, RF1, RF2Терминатор t-g7MS1, RFl, RF2, MS8xRF3Ген patTC1507, 59122 A2704-12, A5547-127, T25, T45,ПЦР мишеньГМ линии сои, кукурузы и рапса, содержащие данный элемент Bt11, DAS-59132-8, 281-24-236 Topas 19/2, DAS-44406-6, SYHT0H2, MZHG0JG, MON 87419 Выявление регуляторных элементов и целевых генов, используемых для получения ГМО растительного происхождения, осуществляется в соответствии с национальными и (или) межгосударственными стандартами, действующими в Российской Федерации. Таблица № 3. Критерии эффективности методики идентификации ГМО № п/п Характеристика Описание характеристики Критерий Методы оценки критерия 1Специфичность ПЦРСпособность ПЦР тест-системы выявлять только целевую ДНКПЦР тест-система должна выявлять целевую ДНК. ПЦР тест-система не должна давать ложноположительных результатов, в том числе выявлять ДНК близкородственных и неродственных биологических видов, в 100% проводимых исследованийДля оценки специфичности используют контрольные панели образцов. В состав панели входят образцы, содержащие целевую ДНК и не содержащие целевую ДНК 2Чувствительность ПЦРНаименьшее содержание копий целевой ДНК, которое может быть определено с использованием данной ПЦР методики, в первую очередь, зависит от свойств используемых праймеров и зондовЧувствительность должна быть не ниже 100 копий целевой ДНК, например, плазмидной, в одной ПЦР реакцииПроводят исследования ряда десятикратных разведений целевой плазмидной ДНК с известной концентрацией в двух повторах каждое. Определяют максимальное разведение, при котором ДНК воспроизводимо выявляется (в двух повторах) 3Эффективность ПЦРХарактеризует прирост матрицы на каждом цикле амплификацииЭффективность ПЦР должна быть не ниже 90%. Это соответствует значению наклона линейной области зависимости Ct от логарифма концентрации ДНК матрицы (slope): не ниже - 3,6 (приемлем диапазон slope 3,1 - 3,6)Для оценки эффективности ПЦР проводят амплификацию с рядом десятикратных разведений целевой плазмидной ДНК (пункт 2 настоящей таблицы) в двух повторах каждое. По результатам амплификации строят график зависимости Ct от логарифма концентрации ДНК матрицы. Определяют наклон линейной области (slope). Эффективность ПЦР оценивают по уравнению: E = [10(-1/slope)]-1, в идеальном случае - при удвоении количества ПЦР продукта за один цикл: Е = 100%, (slope = -3, 32) 4Предел обнаружения ПЦР-тест системы (LOD)Отражает минимальное количество биологического искомого объекта в исследуемом образце, которое может достоверно обнаружить данный методЧем меньше искомого биологического объекта способен выявить метод, тем выше его чувствительность. Определяется экспериментально, но должен составлять не более 0,1%Готовят ряд модельных образцов с разным содержанием целевой матрицы. Готовят образцы целевого ГМО ингредиента (от 5% до 0,001% содержания) в соответствующей матрице. Исследуют приготовленную панель с использованием ПЦР методики. Определяют минимальное 1 содержание ГМО ингредиента в тотальной ДНК организма, при котором ГМО воспроизводимо выявляется (в десяти повторах) 5Предел количественного определения (LOQ, quantitation limit)Наименьшее количество (концентрация) вещества в образце, которое может быть количественно оценено с использованием методики с требуемой правильностью и внутри лабораторной прецизионностьюПредел должен быть не более 0,1%. На пределе чувствительности относительное стандартное отклонение (RSD) не должно превышать 20%. Истинное значение измеряемой величины должно входить в полученный при измерениях доверительный интервалИсследуют 10 повторов 0,1% ГМО стандарта по ПЦР методике. Рассчитывают среднее значение содержания ГМО в образце и относительное стандартное отклонение (RSD). Сравнивают рассчитанное стандартное отклонение (RSD) с критерием 20%. Также оценивают, входит ли истинное значение в доверительный интервал полученного среднего значения 6Аналитическая область (dynamic range)Интервал определяемых аналитических характеристик, в котором получаемые результаты имеют приемлемый уровень правильности и прецизионности, приемлем диапазон 0,1% - 5%Диапазон 0,1% - 5% ГМО экспериментальных данных, должен удовлетворять линейной модели (пункт 7 настоящей таблицы)Проводят исследования образцов с различным содержанием ГМО. Оценивают линейность зависимости аналитического сигнала 7ЛинейностьНаличие линейной зависимости аналитического сигнала в анализируемой пробе в пределах аналитической области методики. Оценивается как R2 коэффициент корреляции, определяющий верность модели линейной зависимости Ct от логарифма концентрации калибровочных образцовR2 коэффициент для калибровочных образцов должен быть не менее 0,98%Исследуют в двух повторах 0,1%, 1,0% и 5% калибровочные ГМО стандарты по ГЩР методике. Строят калибровочную прямую (dCt от lgC), оценивают коэффициент корреляции данных с линейной зависимостью (R2) 8ПравильностьПравильность методики характеризуется отклонением среднего результата определений, выполненных с ее использованием, от значения, принимаемого за истинноеМетодика дает корректные результаты, если значения, принимаемые за истинные, лежат внутри доверительных интервалов соответствующих средних результатов анализов, полученных экспериментально по данной методикеГотовят образцы из калибровочных стандартов 0,1%, 1,0% и 5% с добавлением матриц различного происхождения (для этого смешивают стандарты с другими ингредиентами, сухим молоком, мясным фаршем, рыбной мукой). Исследуют образцы по ПЦР методике в двух повторах. Оценивают, входит ли истинное значение в диапазон погрешности полученного среднего значения для каждого образца При использовании методики, основанной на ПЦР, исследование включает последовательные процессы: подготовку проб, выделение нуклеиновых кислот из образцов, амплификацию заданных фрагментов нуклеиновых кислот, детекцию продуктов амплификации, анализ и интерпретацию результат. Таблица № 4. Критерии эффективности методики полногеномного секвенирования Этап анализа Характеристика Описание характеристики КритерийПодготовка библиотеки для секвенированияКонцентрация геномной ДНК не менее 0,2 нг/мклРазмер фрагментов ДНКРаспределение фрагментов по длинам, устанавливается электрофоретически (например, на капиллярных анализаторах)распределение в диапазоне 250-1000 п.н. Максимум распределения 300-500 п.н.Распределение качества идентификации нуклеотидовQ=-10log10p, где р - вероятность неправильного определения нуклеотидаQ>20, то есть вероятность ошибки не более 0,01Среднее качество прочтения Q>25Проведение массового параллельного секвенированияСлужебные последовательностиНаличие служебных последовательностей (адаптеров, индексов) в прочтениидолжны отсутствоватьПокрытие чтениячисло чтений, содержащих определенный нуклеотид последовательности геномане менее десятикратного покрытияПредставленность нуклеотидов в каждом циклеМаксимальное отклонение между А и Т или G и Сне более 20% в любой позицииGC-состав на прочтениеСумма отклонений от ожидаемого распределенияне более 30% прочтений